为评价二氧化氯消毒剂对 非洲猪瘟 病毒核酸的降解能力，基于栏舍、车辆、食材、物资等不同的消毒应用场景，基于已发表的学术文章与国外应用经验，选择不同的使用浓度，与非洲猪瘟假病毒标准物质在常温下分别作用10min、20min，通过荧光定量PCR检测病毒核酸来评估不同消毒剂对核酸降解的效果。结果显示：10-20ppm的二氧化氯溶液对高浓度与低浓度的非洲猪瘟假病毒均具有良好的杀灭及降核酸作用。本研究评价了二氧化氯消毒剂对非洲猪瘟假病毒的降解效果，可为非洲猪瘟防控体系中二氧化氯消毒剂的使用提供数据支撑。
引言
2018年8月，我国首次发生非洲猪瘟（African Swine Fever,ASF），给国内养猪业造成了巨大的经济损失。目前全球仍未研发出安全、有效的 非洲猪瘟疫苗 或特效药，随着毒株的多样化，防控难度加大。 生物安全 体系建设与紧急处置是目前防控非洲猪瘟唯一的方法。消毒作为生物安全的重要环节，起到切断传播途径、消灭 非洲猪瘟病毒 的关键作用。
然而，目前商业化消毒药品类繁多，包括：强碱类、过氧化物类、氯制剂、醛类等，不同消毒剂对非洲猪瘟等病毒的消杀作用不同，也有不同的应用场景。
ClO2具有广谱抗菌活性，对细菌、病毒、真菌有较强的杀灭作用，对人员、环境和畜群无任何毒副作用，主要用于食品、疫苗、饮水等领域消毒。超纯氯是由荷兰TwinOxide公司出品的超高纯度、超级稳定的二氧化氯产品，是WHO认可的唯一一款食品类消毒剂。其含有99.99%高纯度、超稳定的液态二氧化氯消毒剂。
为评价二氧化氯对ASFV的杀灭与降核酸效果，本研究拟采用荧光定量PCR方法检测不同品类与浓度消毒剂对ASFV假病毒标准物质作用效果，以期为猪场使用二氧化消毒剂对物资、食材、饮水等消毒提供数据支撑。
1.材料与方法
1.1 消毒剂
ClO2消毒剂，商品名：超纯氯，荷兰TwinOxide公司生产；过硫酸氢钾粉，某进口品牌。试验时消毒剂均在有效期内。
1.2 病毒
基于生物安全考虑，本试验采用非洲猪瘟假病毒标准物质（11000拷贝/ul）代替ASFV活病毒，采购于中国动物疫病预防控制中心。
1.3 其他试剂及仪器
非洲猪瘟荧光定量PCR检测试剂盒，购自青岛立见生物科技有限公司；病毒DNA提取试剂盒，购自上海基灵生物科技有限公司；荧光定量PCR仪（ABI-Stepone），购自ABI公司；各量程移液器，购自Eppendorf公司。
1.4 方法
1.4.1 二氧化氯溶液、过硫酸氢钾溶液对高浓度ASFV假病毒核酸破坏能力的效果
先将非洲猪瘟假病毒标准物质进行稀释，每个反应加入的 ASFV标准物质起始量为4.4 × 104个拷贝，Ct值约25.4（强阳性，与血液与栋舍内浓度类似）。同时配置10ppm、20ppm、30ppm浓度的二氧化氯溶液和1:200的过硫酸氢钾溶液，然后将3组不同浓度的二氧化氯溶液、过硫酸氢钾溶液与ASFV标准物质进行等体积混匀，相互作用10min、20min。对照组为：纯水+ASFV标准物质，等体积混匀。共5组，每组设置3个平行重复。作用时间结束后，分别取样进行荧光定量PCR反应。
1.4.2 不同浓度二氧化氯对低浓度ASFV假病毒核酸破坏能力的测定
先将非洲猪瘟假病毒标准物质进行稀释，每个反应加入的 ASFV标准物质起始量为1.1 × 102个拷贝，Ct值约30（弱阳性，与车辆、人体及物资中浓度类似）。同时配置10ppm、20ppm浓度的二氧化氯溶液和1:200的过硫酸氢钾溶液，然后将2组不同浓度的二氧化氯溶液、过硫酸氢钾溶液与ASFV标准物质进行等体积混匀，相互作用10min、20min。对照组为：纯水+ASFV标准物质，等体积混匀。共4组，每组设置3个平行重复。作用时间结束后，分别取样进行荧光定量PCR反应。
2.结果
2.1 二氧化氯溶液、过硫酸氢钾溶液对高浓度ASFV假病毒核酸破坏能力的效果
表1 不同消毒剂与高浓度ASFV假病毒标准物质作用后qPCR结果
试验结果表明：病毒原液Ct=25.4，对照组平均Ct值几乎没有变化（25.74），说明核酸稳定，实验室检测体系稳定，自然降解对试验结果无影响。与对照组相比，当过硫酸氢钾消毒液（常用工作浓度1:200）与病毒作用10min时，Ct值升高0.63，病毒核酸残留1/2^0.63=64.6%；作用20min时，Ct值升高1.63，病毒核酸残留1/2^1.63=32.3%。与对照组相比，当10ppm超纯氯与病毒作用10min时，Ct值升高4.28，病毒核酸残留1/2^4.28=5.15%；作用20min时，Ct值升高5.34，病毒核酸残留1/2^5.34=2.49%。当20ppm超纯氯与病毒作用10min时，Ct值升高6.86，病毒核酸残留1/2^6.86=0.86%；作用20min时，Ct值升高7.11，病毒核酸残留1/2^7.11=0.72%。当30ppm超纯氯与病毒作用10min时，Ct值升高7.52，病毒核酸残留1/2^7.52=0.54%；作用20min时，Ct值升高8.84，病毒核酸残留1/2^8.84=0.22%。综上所述，不同浓度的二氧化氯对病毒核酸均有显著的降解作用，并随着浓度增加，对病毒的核酸降解能力增强，20ppm二氧化氯作用10分钟可消灭99.14%的病毒。二氧化氯降解核酸的能力显著优于过硫酸氢钾。二氧化氯消毒液作用10min和20min，对病毒核酸的降解效果的差异不显著，在临床上，可采用10分钟浸泡消毒。
2.2 二氧化氯溶液、过硫酸氢钾溶液对弱阳性ASFV假病毒核酸破坏能力的效果
表2 不同消毒剂与低浓度ASFV假病毒标准物质作用后qPCR结果
备注：ND代表在此处未进行检测；-代表检测结果阴性；
结果显示：原始溶液中含有ASFV的Ct值为29.45，此浓度一般为实验室检测到的物资、车辆、人员、食材等污染的zui高浓度值。与对照组相比，1:200倍稀释的过硫酸氢钾溶液对病毒作用20分钟后，将Ct值升高了0.92（平均值是30.37），相当于核酸残留52.85%，与原始溶液差异不显著；10ppm的二氧化氯溶液作用10分钟后，平均Ct值为37，较原始溶液升高了7.55，相当于相当于核酸残留0.53%；作用20分钟后，ASFV核酸完全被降解；而20ppm二氧化氯作用10分钟后就已经完全降解了ASFV核酸。结果表明：对于物资、食材、人体污染，10-20ppm二氧化氯作用20分钟即可完全消除核酸。
3.讨论
本试验通过qPCR检测方法，探讨了二氧化氯消毒剂（超纯氯）对ASFV核酸的破坏作用，zui终确定了10-20ppm的二氧化氯溶液对高浓度与低浓度的ASFV均具有良好的消灭及降核酸作用。与过硫酸氢钾消毒液相比，二氧化氯消毒后对qPCR检测结果影响zui显著，10ppm二氧化氯作用10分钟即可将CT值为29.4的病毒核酸降解99.47%。本研究中使用的二氧化氯，其分子的电子结构呈不饱和状态，具有强烈的氧化性，通过掠夺富电子基团的电子，使病原菌表面的蛋白质失去活性，且可以进入到病原内部，降解病原核酸。
因此，对于蔬菜、物资、人体等ASFV含量较低的物品，推荐使用的消毒浓度为10ppm，持续浸泡10-20分钟后取出。因为二氧化氯属于A1类的食品级消毒剂，无毒副作用，取出的表面湿润的物资与蔬菜不需要再使用干净的水进行冲淋（备注：有些消毒剂需要用水反复冲淋以降低残留的有害物质），残留的二氧化氯会持续的作用72小时以上，将各类病原彻底消灭。此外，二氧化氯对蔬菜等易腐蚀食品具有保鲜作用。
由于qPCR检测的是ASFV病毒核酸，若检测结果阴性，说明病毒死亡且核酸降解。如果检测结果呈阳性，只能说明ASFV核酸依然存在，qPCR方法无法证明病毒是否具有传染能力。若验证病毒活性，需要通过病毒培养试验验证，对实验室生物安全等级要求高，且成本高、时间长。
在猪场生物安全体系构建中，需要依据消毒剂的安全性、有效性、经济性、稳定性等多维度进行消毒剂的选择，不同的消毒有不同的使用浓度及应用场景。
二氧化氯作为食品级的消毒剂，其优势在于安全性，通过测试其可有效的消灭非洲猪瘟病毒。据研究：24ppm二氧化氯10s可以消灭99.9%的新冠病毒。
本试验评估了不同浓度二氧化氯溶液在不同时间下对不同浓度非洲猪瘟病毒的核酸降解作用，结果证明：对于CT值29.4的ASFV（1.1×10^2拷贝），10ppm二氧化氯10min能降解99.47%的核酸，20min可将核酸100%降解，据此推荐10-20ppm二氧化氯作用10-20min用于物资、食材的进场消毒。
